液相色譜是根據不同溶質在流動相和固定相之間保留的差異進行分離和測定的方法。通常用容量因子k·來表征溶質保留值得大小，k，=(tR-t0)/t0，k·

越大則該物質保留越強。容量因子k·隨固定相、流動相濃度c、溫度的不同而變化。在固定相溫度不變的情況下有以下關系式：

lnk·=-Zlnc+b(Z和b為常數)

由此可見，隨流動相濃度c增加，容量因子k·減小。Z是每種物質的特征參數，小分子Z一般為3-5，大分子Z一般為10-100。對于小分子的樣品，我們可以通過采用合適濃度的流動相來使每種物質得到分離，即平常所用的等度液相色譜分析。若對于一個既有小分子，又有大分子的樣品（如含聚合物），由于Z相差較大，在相同的流動相濃度下，容量因子k·差距就非常大，簡單的講，在等度情況下，有時小分子的保留時間在4-5min，大分子保留時間可能在100min以上，更有甚者在有限的時間內不出峰。

二元高壓分析梯度液相色譜儀梯度分析法就是為解決這個問題產生的。它是采用特殊的設備使流動相的濃度隨時間變化，對保留弱的用濃度小的流動相，對保留強的用濃度大的流動相，使各組分較為均勻的流出。例如對于某樣品用60％流動相、80％流動相和梯度（30min內從60％-100％）的分離效果如下。

從上可以看出用60％流動相分離效果好，但用時150min，用80％流動相分離效果已經很差了，用時仍達80min，而用梯度的方法分離效果很好，用時只有50min，另外，保留時間長的色譜峰沒有明顯變寬。

2.二元高壓分析梯度液相色譜儀設置方法

通常有兩種梯度方式，一種是低壓梯度，一種是高壓梯度。低壓梯度只用一個輸液泵，靠梯度單元中電磁閥開關時間的比例來控制AB液的比例實現流動相濃度的變化，例如需控制A:B=40:60，在很小的時間段如1秒，CD閥常關，A閥開4/10秒，B閥開6/10秒，任意時間四個閥只有一個開，輸液泵流出的流動相AB液是一節一節相連的，經混合器混合成一定比例的流動相。低壓梯度zui多可有四種流動相。

3.二元高壓分析梯度液相色譜儀注意事項及常見故障排除

1.更換流動相后，要用新流動相沖洗管路和脫氣機。

2.及時觀察兩個泵的壓力變化。如壓力變化過大，通常是其中一個泵抽空或不流液。

打開放空閥，用注射器在廢液管端吸，使排液順暢。

3.通常情況下，梯度基線是逐漸升高的，但如出現較大的鼓包是不正常的。原因很

多，可先用純甲醇沖洗整個儀器管路，或更換新配的流動相。

4.注意開機順序，依次是監測器，付泵，主泵，脫氣機。有時會出現主泵控制不上

付泵的情況，可按主泵PUMP鍵測試，正常情況是按主泵PUMP鍵，付泵應與主泵同時開或關。出現錯誤時可將付泵再開一次。

5.梯度方法由于流動相的純度等問題易出現鬼峰，做完樣品后應打空白，樣品不積

空白中出現的峰。

6.100％水的流動相勤用勤配，防止霉變。